Ingegneria degli anticorpi
Ingegneria anticorpale mediante elettrochimica
- Riduzione, coniugazione e riossidazione elettrochimica degli anticorpi
- Tecnologia verde – elettroni al posto di sostanze chimiche tossiche
- Selettivo – genera catene leggere e pesanti
- Veloce – pochi secondi rispetto alle ore necessarie per gli approcci chimici (ad es. TCEP, DTT).
Questo nuovo approccio elettrochimico fornisce un metodo rapido ed efficiente per la riduzione selettiva, la coniugazione e la riossidazione degli anticorpi senza la necessitĆ di sostanze chimiche riducenti. La riduzione degli anticorpi nelle sue catene leggere (Lc) e pesanti (Hc) avviene con il metodo elettrochimico precedentemente pubblicato, basato su impulsi di potenziale a onda quadra applicati all’elettrodo Ti proprietario di Antec. Successivamente, la cisteina libera generata dalla riduzione elettrochimica dell’anticorpo puĆ² essere coniugata. Infine, la cisteina libera su Lc e Hc puĆ² essere riossidata molto rapidamente e selettivamente per riformare l’anticorpo in alte rese. Il trattamento elettrochimico non ha influito sull’affinitĆ di legame degli anticorpi, eliminando la necessitĆ di utilizzare prodotti chimici aggressivi e di effettuare ulteriori e noiose operazioni di pulizia.
Per maggiori dettagli: vedere anche la nostra pagina dedicata alla tecnologia.
Rappresentazione grafica di un anticorpo con legami disolfuro che tengono insieme le catene pesanti e leggere. La rottura di un legame disolfuro in un reattore elettrochimico a flusso passante richiede un potenziale di circa -1 V.
Spettri di massa
La riduzione elettrochimica dei legami disolfuro si rivelerĆ probabilmente un importante progresso tecnologico non solo nell’analisi degli anticorpi, ma anche nella progettazione di nuovi terapeutici a base di anticorpi, come anticorpi bi-specifici o coniugati anticorpo-farmaco. Gli spettri MS sotto riportati mostrano i prodotti di reazione (Lc e Hc) dopo l’accensione della cella di reazione (B e D).
Infusione di una soluzione di anticorpi acidificata nello spettrometro di massa con Ī¼-PrepCell spento. (A) ha dato luogo a un inviluppo di cariche che si diffonde tra m/z 2200 e 4000, con l’anticorpo intatto che trasporta circa 40-60 cariche. Quando la cella ĆØ stata accesa (B), ĆØ stato osservato uno spostamento dell’inviluppo di carica dell’anticorpo verso m/z inferiori (~1000-2500).
Lo spettro (C) deriva dalla deconvoluzione del segnale MS (A) ottenuto con la cella OFF e conferma che l’anticorpo ĆØ intatto. D ĆØ stato ottenuto con la cellula accesa e mostra soprattutto specie con pesi molecolari di circa 25 e 50 kDa, corrispondenti alle masse di Lc e Hc. L’intensitĆ molto bassa del segnale MS per le specie con peso molecolare superiore a 50 kDa conferma ulteriormente la riduzione selettiva dei legami disolfuro intercatena degli anticorpi in alte rese.
Spettri di massa ad alta risoluzione di un anticorpo monoclonale prima/dopo la riduzione elettrochimica dei legami disolfuro.
Test di legame ELISA
Le curve ottenute in ELISA per tre diversi anticorpi – in forma nativa (verde), ridotta elettrochimicamente e riossidata (rosso e blu) – mostrano un eccellente accordo, illustrando che il trattamento elettrochimico degli anticorpi non influisce sulla loro attivitĆ di legame nĆ© sulla loro attivitĆ biologica, anche quando si mantiene l’anticorpo ridotto per diverse ore in ambiente acido.
Per gentile concessione di Xin Cheng e Arielle Verdi (Morphotek Inc., Exton, PA).
Valutazione dell’affinitĆ di legame del ligando mediante ELISA.